Стволовые клетки слизистой оболочки желудка: от современной терминологии к перспективной канцерпревенции

Рак желудка (РЖ) является глобальной проблемой в здравоохранении. Несмотря на успехи в лечении, вследствие частого рецидивирования и метастазирования опухолей общий прогноз неблагоприятный [1]. Необходим поиск новых терапевтических подходов для улучшения клинических исходов РЖ. Модель раковых стволовых клеток (РСК) предложена для объяснения опухолевой гетерогенности, определяющей высокую частоту рецидивов и резистентность к системной терапии [2]. РСК идентифицированы во многих солидных злокачественных опухолях, включая РЖ. Воздействие на активное меньшинство РСК может увеличить эффективность терапии [3].

Опухолевая гетерогенность

Большинство опухолей имеет моноклональное происхождение, но к моменту обнаружения она состоит из генетически, эпигенетически и фенотипически гетерогенных клонов. Две основные концепции пытаются объяснить эту гетерогенность: гипотеза раковых стволовых клеток и модель клональной (стохастической) эволюции (рис. 1).

Модель клональной эволюции предполагает, что каждая опухолевая клетка обладает способностью инициировать образование опухоли. Прогрессия направляется редкими стохастическими событиями, происходящими во всех клетках. Клетки с мутациями, которые дают преимущество в росте, будут преобладать над остальными клетками опухоли и могут образовать новый клон, содержащий клетки различного фенотипа, имеющие различный пролиферативный потенциал [4–6].

Теория РСК, сформулированная в 1997 году [7], базируется на утверждении, что в структуре популяций опухолевых клеток существует четкая иерархия, на вершине которой находится популяция трансформированных клеток, имеющих сходные с нормальными стволовыми клетками свойства. РСК называют опухоль-инициирующими клетками (tumor-initiating cells, TIC) или опухоль-генерирующими клетками (tumor-propagating cells, TPC) [8,9]. Согласно концепции, популяция РСК:

1. Составляет незначительную долю общей популяции клеток опухоли;
2. Экспрессирует специфический набор поверхностных маркеров;
3. Селективно поддерживает способность к онкогенезу в отличие от других популяций опухолевых клеток;
4. Поддерживает рост гетерогенной массы, содержащей полный набор частично (или полностью) дифференцированных раковых клеток;
5. Образует отдельный пул клеток, идентифицируемый биологическими и физико-химическими методами (по меньшей мере два пула клеток в опухоли: РСК и их производные — дифференцированные в разной степени клетки);
6. Проявляет способность, подобно нормальным стволовым клеткам, к неограниченному самообновлению и дифференцировке по многим направлениям [9];
7. Проявляет высокую устойчивость к стандартной терапии [2].

Рис. 1 | Модели опухолевой гетерогенности. А — эволюционная стохастическая модель; Б — иерархическая модель раковых стволовых клеток [5].

Самообновление желудочного эпителия и стволовые клетки желудка (СКЖ)

Строение слизистой оболочки желудка человека гистологически неоднородно. Принципиально отличают фундальные и антральные желудочные единицы [10]. Непрерывное клеточное обновление желудочного эпителия происходит за счет пролиферации и дифференцировки мультипотентных СКЖ, впервые обнаруженных в области перешейка желез. Эти недифференцированные клетки обладают двумя определяющими характеристиками. Во-первых, они способны длительно поддерживать свою популяцию (самообновление). Во-вторых, взрослые стволовые клетки являются источником всех клеточных линий желудочных единиц из-за асимметричных делений, ведущих к различным типам клеток-предшественников, которые пролиферируют (транзиторные амплифицирующиеся клетки) и дифференцируются в зрелые клетки (мультипотентность) [11]. В регуляции СКЖ участвуют следующие сигнальные пути: Wnt/[beta]-катенин (активация самоподдержания и ингибирование дифференцировки), киназа PI3K/Akt (рост, выживание и пролиферация клеток), трансформирующий фактор роста [beta] (TGF-[beta]) (ингибирующее влияние на пролиферацию клеток) и инсулиноподобный фактор роста 1. Ниша стволовых клеток образует сложную динамическую систему с нервной системой и сосудистым руслом [12].

Потомки стволовой клетки распространяются в двух направлениях (к просвету и к основанию железы) и образуют три основных клеточных линии с 11 типами клеток (рис. 2):

1. Поверхностные (добавочные) мукоциты: прекурсоры поверхностных мукоцитов, поверхностные пре-мукоциты, зрелые поверхностные мукоциты (AAA лектин и TFF1);
2. Главные клетки: прекурсоры шеечных мукоцитов, шеечные пре-мукоциты, зрелые шеечные мукоциты (GSII лектин и TFF2), предшественники зимогенных клеток и зрелые зимогенные клетки (внутренний фактор [GIF], пепсиноген, Mist1);
3. Париетальные клетки: прекурсоры париетальных клеток, пре-париетальные клетки, париетальные клетки (H/K-АТФаза и VEGF).

Темпы обновления париетальных и зимогенных клеток ниже, чем остальных [13].

Рис. 2 | Схематическое изображение желудочной единицы человека и ее двунаправленного самообновления из мультипотентных стволовых клеток. Представлены стадии дифференцировки основных клеточных линий и некоторые из характерных секретируемых продуктов (предложена автором статьи на основе исследований [10,13,14,22]).

Также встречаются эндокринные клетки 5 основных типов: G-клетки (гастрин-продуцирующие), D-клетки (соматостатин-продуцирующие), энтерохромаффинные (EC) клетки (серотонин-продуцирующие), EC-подобные клетки (гистамин-продуцирующие) и X/A клетки (грелин-продуцирующие). В результате асимметричного деления мультипотентной СКЖ образуется эндокринный прогенитор (маркер Ascl1), под влиянием различных транскрипционных факторов подвергающийся коммитированию в определенную клеточную линию. Бипотентная клетка-предшественник D- и G-клеток экспрессирует маркеры NGN3 и PAX6. NKX6-3, PDX1 и ARX необходимые для ее дифференцировки в G-клетки, PAX4 требуется для продукции D-клеток. Интересно, что в теле желудка EC-клетки могут формироваться из неэпителиальных тучных клеток [14].

Молекулярные маркеры СКЖ обнаружены совсем недавно. Первым биомаркером стал виллин (Villin). Это специфичный для эпителиальных клеток кальций-регулируемый белок, модулирующий реорганизацию актиновых микрофиламентов. В отличие от активно пролиферирующих стволовых клеток перешейка, виллин-положительные СКЖ (V-СКЖ) находятся в состоянии покоя. Они расположены в нижней трети антральных желез [10].

Другая популяция СКЖ экспрессирует рецептор Lgr5, связывающий G-белок (Gpr49). Lgr5+ СКЖ (L-СКЖ) встречаются в основании фундальных и антральных желез в желудке эмбриона, но в постнатальном периоде ограничены антрумом. По аналогии с V-СКЖ, L-СКЖ также мультипотентны, но обладают высокой пролиферативной активностью [15]. Сосуществование активных и покоящихся стволовых клеток обнаружено в нескольких типах тканей. Считается, что активные стволовые клетки отвечают за физиологическое обновление ткани, а покоящиеся служат в качестве резерва, прежде всего, в случае травмы [16]. Особый интерес вызывает субпопуляция полностью коммитированных зимогенных клеток в основании фундальных желез, обладающих мультипотентностью. Эти клетки экспрессируют член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Troy. Troy+ клетки (Т-СКЖ) пролиферируют медленно и активируются после цитотоксического медикаментозного повреждения ткани [10].

Популяция СКЖ, экспрессирующая маркер Sox2 (S-СКЖ), рассеяна в перешейке фундальных и антральных желез, а также в их нижних частях. Они обладают мультипотентностью и имеют потенциал к самообновлению. Интересно, что S-СКЖ происходят из фетальных Sox2+ клеток-предшественников. S-СКЖ наиболее близки по характеристикам к СКЖ, первоначально обнаруженным в пролиферативной зоне перешейка [17].

Недавно была выделена новая популяция стволовых клеток (в позиции +4) в мышиной антральной железе с экспрессией рецептора к гастрину CCK2 (C-СКЖ). Они локализованы немного выше типичного расположения L-СКЖ. C-СКЖ способны подвергаться конверсии за счет гормонального триггера (обработка прогастрином, но не амидированным гастрином, приводит к переходу C-СКЖ в L-СКЖ) [18].

Важной проблемой является соотношение моноклонального происхождения желудочной единицы и факта неоднородности популяции стволовых клеток. Наиболее вероятной кажется конкурентная модель, которая предполагает достижение конкретной стволовой клеткой клонального доминирования [19]. СКЖ демонстрируют уникальную пластичность, перемещаясь в различных направлениях между стадиями мультипотентности и коммитированных прогениторов. Вероятным индуктором трансдифференцировки является Notch-сигналинг [20].

Структура

Canaliculus

А каналец

это адаптация, обнаруженная на париетальных клетках желудка. Это глубокая складка или небольшой канал, который служит для увеличения площади поверхности, например для секреции. Мембрана париетальных клеток динамична; количество канальцев увеличивается и уменьшается в соответствии с секреторной потребностью. Это достигается за счет слияния канальцевых предшественников, или «канальцев-пузырьков», с мембраной для увеличения площади поверхности и реципрокного эндоцитоза канальцев (реформирование канальцевых пузырей) для ее уменьшения.

РСК в желудке

Поскольку РСК образуются из регионарных стволовых клеток [19], закономерно предположить связь СКЖ и РЖ. Для обнаружения предполагаемых маркеров РСК (табл. 1) были использованы два основных подхода. В первом использованы генетические манипуляции и трейсинг клеточных популяций РСК на мышиных моделях. Другой основан на изучении мышиных клеток из ксенотрансплантатов РЖ человека [21,22].

Таблица 1 | Обзор исследований иммуногистохимических маркеров РСК при РЖ.

Также для идентификации РСК при РЖ были рекомендованы маркеры стволовых клеток ОСТ-4, SOX2, NANOG [26].

V-СКЖ и опухолевый супрессор Klf4. V-СКЖ сосредоточены в пределах малой кривизны антрального отдела желудка [10], места частой локализации РЖ [12]. Трансформация V-СКЖ может привести к РЖ. Транскрипционный фактор Klf4 (Kruppel-like factor 4) принадлежит к Klf-семейству «цинк-пальцевых» и активно экспрессируется в кишечнике, является одним из четырех транскрипционных факторов «коктейля Яманаки», достаточных для трансформации фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [27]. Снижение экспрессии Klf4 ассоциировано с РЖ и прогрессией опухоли, что позволяет рассматривать его как опухолевый супрессор [12]. Удаление Klf4 в мукоцитах мышиного желудка с использованием трансгена Foxa3-Cre, экспрессирующего Cre рекомбиназу (cyclic recombinase), приводит к распространению гипертрофии и предраковой метаплазии в антральном и фундальном отделах в течение 6 месяцев [28]. В этой модели инициация опухоли значительно ускоряется при введении химического мутагена N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ). При этом желудочные аденомы не прогрессируют в аденокарциномы даже в присутствии НММ, что свидетельствует о необходимости дополнительных генетических мутаций для прогрессирования рака. Тем не менее, эти исследования установили роль трансформации V-СКЖ в возникновении РЖ, а также супрессорную активность Klf4 [29].

РСК желудка костномозгового происхождения

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) костного мозга в условиях хронического воспаления мигрируют в слизистую оболочку желудка, где активно взаимодействуют с микросредой. В условиях «нездорового» микроокружения (избыток активных форм кислорода (АФК) и хроническое воспаление) ММСК может спровоцировать появление аденокарциномы [30].

H. pylori (HP) и дизрегуляция самообновления желудочного эпителия

H. pylori-индуцированный хронический гастрит является самым важным фактором риска для некардиального РЖ [12]. HP-инфекция приводит к характерным провоспалительным сигналам: активации факторов ядерной транскрипции NF-kB и АР-1, высвобождению интерлейкина-8 (IL-8) и фактора некроза опухоли альфа (TNF[alpha]). HP способны колонизировать антральные железы, что приводит к изменению динамики самообновления клеток за счет пролиферации L-СКЖ. Предполагается, что HP-инфекция связана с повреждением ДНК в L-СКЖ [31].

Отличительной чертой карцином (эпителиальных опухолей) является изменение фенотипа клеток для обретения инвазивных свойств. Например, изменение полярности клетки: из апикально-базолатерального (в эпителиальных клетках) в плоский тип (мезенхимальный фенотип). Этот процесс известен как эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [26]. Опухолевые клетки, подвергшиеся ЭМП, переходят в стволоподобное состояние (экспрессия Bmi1). HP-инфекция инициирует ЭМП с помощью фактора транскрипции ZEB1 и микроРНК miR-200. Классический маркер эпителиального фенотипа Е-кадгерин/CDH1 не экспрессируется в мезенхимальных клетках, что способствует утрате межклеточных контактов и инвазивному росту. Многочисленные исследования установили связь CDH1 мутаций с развитием наследственного РЖ диффузного типа [32].

Аутоантитела к клеткам желудка, секретирующим соляную кислоту и внутренний фактор Кастла, появление которых при аутоиммунном процессе имеет патогенетическое значение в атрофии слизистой желудка, нарушении всасывания витамина В12 и развитии пернициозной анемии.

Синонимы русские

АПКЖ.

Синонимы английские

Gastric Parietal Cell Antibodies; GPA; Antiparietal cell antibody; APCA.

Метод исследования

Непрямая реакция иммунофлюоресценции.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Аутоиммунный гастрит – вариант атрофического гастрита (хронического гастрита типа А). Его причиной является выработка собственной иммунной системой антител к париетальным клеткам слизистой желудка. Заболевание бывает длительно не диагностированным вследствие субклинического течения, отсутствия жалоб и явных объективных изменений пищеварения. Аутоиммунный гастрит может протекать самостоятельно или в сочетании с аутоиммунными процессами в щитовидной железе, алопецией и витилиго.

Появление антител к париетальным клеткам при аутоиммунном гастрите приводит к разрушению данной популяции клеток, хроническому воспалению, прогрессирующей атрофии слизистой с кишечной метаплазией. Париетальные (обкладочные) клетки желудка расположены преимущественно в железах слизистой оболочки дна желудка. Их главная функция – секреция соляной кислоты, которая является важным компонентом пищеварения человека, и внутреннего фактора Кастла, необходимого для всасывания витамина В12 из пищи.

Антигенами для АПКЖ являются поверхность париетальной клетки, митохондрии и бета-субъединица Н+/К+-АТФазы, обеспечивающей функцию протонного насоса, необходимого для секреции соляной кислоты в полость желудка. Повреждение париетальных клеток вызывает снижение секреции соляной кислоты (гипохлоргидрию) или ее полное отсутствие (ахлоргидрию, ахилию), что ведет к нарушению всасывания многих питательных веществ (мальабсорбции). При дефиците внутреннего фактора Кастла в кишечнике нарушается абсорбция витамина В12, без которого не происходит полноценного формирования красных кровяных телец в костном мозге, развивается В12-дефицитная (пернициозная, мегалобластная) анемия.

Антитела к париетальным клеткам желудка присутствуют у 90 % людей с пернициозной анемией и в 30 % случаев – у их близких родственников. Для данной патологии АПКЖ являются выскоспецифичными, но большая чувствительность характерна для антител к внутреннему фактору Кастла, который обнаруживается у 50 % пациентов с пернициозной анемией.

Титр антител не коррелирует с тяжестью атрофического процесса в желудке, поэтому для мониторинга течения заболевания не применяется.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики мегалобластной (пернициозной) анемии аутоиммунного генеза;
• длядиагностики причин дефицита витамина В12;
• длядиагностики аутоиммунного гастрита.

Когда назначается исследование?

• При выявлении гиперхромной гипорегенераторной анемии по результатам клинического анализа крови;
• при клинических признаках пернициозной (мегалобластной) анемии (бледность, общая слабость, онемение или ощущение покалывания в конечностях, нейропатия, ярко-красный, «лакированный» язык).

Что означают результаты?

Референсные значения:

Причины повышения:

• аутоиммунный гастрит и пернициозная анемия (у 90 % больных);
• аутоиммунный гастрит без пернициозной анемии
• патология щитовидной железы (при тиреоидите Хашимото выявляется у 30 % больных);
• сахарный диабет;
• рак желудка;
• язвенная болезнь желудка;
• миастения;
• болезнь Аддисона;
• железодефицитная анемия;
• витилиго;
• очаговая алопеция.

Что может влиять на результат?

Ложноположительные результаты могут быть получены при повышенном уровне иммунных комплексов и гетерофильных антител в крови.